Gibson无缝克隆常见问题大全｜从入门到精通，一篇搞定！

做克隆做到头秃？酶切连接总是失败？

Gibson组装看似简单，实则坑点密布？

别慌，今天我们把Gibson克隆的「十万个为什么」

一次性讲透，带你从入门选手进阶成克隆老司机！

常见问题 Q&A

Q1: 克隆方式怎么选？

Q2：Gibson克隆最多能同时拼几个片段？产品怎么选？

答: Gibson克隆依赖于同源臂的互补配对，当片段过多时，同源臂易发生错配导致连接失败或错误连接，因此不建议一次性连接大量片段，片段较多时，可分步连接。经测试，DNA Assembly Mix Ultra适用于插入≤10个片段的连接场景，DNA Assembly Mix Mono适用于插入≤3个片段的连接场景。

• DNA Assembly Mix Ultra 克隆转化子数与阳性克隆

• DNA Assembly Mix Mono克隆转化子数与阳性克隆

Q3：最佳克隆位点选择？

答：应避免选择克隆位点上下游 50 bp 内有重复序列的区域。并且克隆位点上下游 20 bp区域内 GC 含量尽量在 40%~60%范围内。

Q4：同源臂要设计多长？

答：一般推荐15~25 bp。当重组转化子产物>10 kb以上时，推荐按20~25 bp。

划重点：同源臂不是越长越好！太长会增加引物合成成本，还可能导致非特异性结合。18 bp左右是性价比最高的选择。

Q5：Gibson引物怎么设计？

 答：具体的操作指南详见：熬过夜的分子实验人必看！Gibson无缝克隆实操干货

Q6：片段和载体的比例怎么算？加多少才合适？

答：摩尔比是关键！载体:插入片段 = 1:1 ~ 1:5，常用1:2。片段载体摩尔比过大时反而会降低连接效率，比例越大，降低越严重。对于单片段插入，片段:载体=20:1时连接效率约为2:1时的20%，片段越多，连接效率下降幅度越显著。

愚公生物也贴心的为大家准备了计算表，详见无缝克隆多片段计算表。

Q7：最小可以插入多小的片段？最大多少？

答：最小建议 50 bp 以上，过短的片段可能会被核酸外切酶完全切除掉。最大可用于全长26 kb质粒构建，片段越大，构建难度越大。

Q8：Gibson反应温度和时间到底是多少？

答：50℃孵育5~60分钟。

为什么是50℃？这是一个平衡点：T5外切酶在50℃活性适中，既能有效外切又不会切太快；同时同源序列在这个温度下能特异性配对，减少非特异性结合。

Q9：Gibson反应产物能直接用于电转化吗？

答：不能直接用于电转化，需要将产物纯化后再用于电转，可以用柱纯化或者乙醇沉淀纯化。

Q10：载体一定要线性化吗？用PCR还是酶切？

答：必须线性化。环状载体无法进行Gibson组装（T5外切酶无法消化环状质粒）。

两种线性化方法对比：

Dam甲基化模板：实验室最常见模板为从dam⁺大肠杆菌提取的质粒模板，使用PCR法扩增线性化载体后，推荐使用DpnI消化原始环状质粒，否则转化后会长出大量原始载体的假阳性菌落，白忙活一场。

Q11：如果同源臂之外有多余的序列且这段序列与相邻组装片段之间不匹配，Gibson组装还能正常进行吗？

答：可以正常进行，DNA Assembly Mix Ultra（EG24204）可以允许同源臂之外不匹配序列长度在50 bp以内不影响同源重组效率，超过50 bp后同源重组效率会严重下降。

测试数据详见：Gibson无缝克隆，你所不知道的

Q12：不同品牌的Gibson试剂盒差别大吗？可以混用吗？

答：不同品牌的Gibson试剂盒全部基于同源重组原理，但不同品牌对产品的优化方向不一致，包括酶的用量、缓冲液配方等，因此不推荐混用，防止实验失败。

常见问题 Q&A

Q13：转化后零菌落/菌落极少？

情况1：感受态效率低下

解决方案：感受态细胞的转化效率至少需>10⁷ CFU/μg。可进行简单检测，转化0.1 ng pUC19质粒，生长1000个菌落，估算转化效率为10⁷ CFU/μg。当重组转化子 产物>10 kb以上时，推荐使用≥10⁸  CFU/μg感受态细胞或者适用于大质粒DNA 和重组产物转化的感受态细胞。

情况2：载体与片段摩尔比不佳或者载体加入量偏低

解决方案：按照说明书推荐的最适用量和比例配制反应体系。载体和插入片段的浓度测定： 若线性化载体与插入片段已经过纯化，且经电泳检测条带单一或无Smear残留时，可使用超微量核酸蛋白检测仪等基于分光光度法的仪器进行浓度测定，但只有当A260/A280在1.8~2.0之间时浓度值可信；若线性化载体与插入片段未经过纯化，也可使用琼脂糖电泳估算样品浓度。

情况3：DNA片段纯度不够

解决方案：对载体和插入片段进行胶回收纯化。由于EDTA等金属离子螯合剂会抑制无缝克隆反应，因此纯化产物应溶解于ddH₂O中，切勿使用Tris-EDTA等缓冲液。如果片段PCR产物未回收，其加样体积不应超过总反应体系的20%。

情况4：反应产物过量

解决方案：转化体系中，无缝克隆反应产物体积不应超过感受态细胞体积的10%

情况5：插入片段编码产物对大肠杆菌有细胞或基因毒性

解决方案：30℃低温培养。

Q14：菌落一大堆，但全是假阳性？

情况1：载体线性化不完全或者载体未纯化

解决方案：酶切制备线性化载体时，提高快速内切酶的使用量，延长反应时间，使用胶回收纯化酶切产物。

情况2：相同抗性质粒污染

解决方案：以质粒为模板进行插入片段PCR扩增时，使用预线性化质粒作为扩增模板，降低PCR扩增中质粒模板的加入量并且对Dam于甲基化模板使用DpnI等甲基化敏感型内切酶对扩增产物进行处理（见Q10），或对产物进行胶回收纯化。

情况3：平板抗性不足

解决方案：确保使用正确的抗生素，并使用新鲜制备的抗生素平板。

Q15：菌落PCR有条带，但测序总是不对？

情况1：插入了，但序列有随机突变

原因：插入片段编码产物对大肠杆菌有细胞或基因毒性。

解决：30℃低温培养

情况2：插入了，但方向反了

原因：同源臂有反向互补序列，导致片段反向插入。

解决：检查同源臂序列，避免反向重复；设计引物时注意方向。

情况3：有大小相似的非特异性扩增

原因：菌落PCR引物非特异性扩增，看起来大小对，实则不是目标片段。

解决：用载体上的通用引物做菌落PCR；或直接提质粒酶切验证。

Q16：组装后出现缺失/重复？序列对不上？

答：考虑基因内部有重复序列：同源臂配对时发生发生错位，产生缺失或重复。
解决：避开重复区域设计同源臂；或延长同源臂增加特异性；或者使用适合重复序列DNA片段克隆的感受态细胞；或者采用酶切连接、Golden Gate方法进行克隆。