AI驱动的从头设计靶向AR的PROTAC多肽
近年来，以 RFdiffusion、ProteinMPNN 和 AlphaFold2 等为代表的深度学习算法在工程蛋白设计方面——尤其是对于多肽结合剂（binder）的设计——取得了令人瞩目的成就。今天给大家推荐一篇由西安交大、二军医大、浙大联合发表于Journal of Medicinal Chemistry的原创研究，作者以雄激素受体（AR）作为靶点，搭建 RFdiffusion + ProteinMPNN + AlphaFold2 + ZDOCK + OpenBPMD 五级串联 AI 自上而下多肽 PROTAC（proteolytic targeted chimeric，蛋白降解靶向嵌合体） 筛选流水线，并据此“自上而下”地设计了一条靶向AR的PROTAC肽，最终成功将其用于雄激素性脱发的治疗。
一、AI 蛋白设计工作流路线图
AlphaFold2、RFdiffusion、ProteinMPNN等深度学习模型已实现蛋白骨架从头生成与序列逆向优化，RFdiffusion 依托扩散模型实现功能约束下全新蛋白骨架生成；ProteinMPNN 通过逆折叠算法为给定骨架匹配稳定相容的氨基酸序列；AlphaFold2 精准预测序列折叠构象，实现设计产物的高通量计算筛选，形成标准化 AI 从头蛋白设计工作流。
图 1 一种用于生成多肽 PROTAC 的自上而下设计工作流
为简化多肽 PROTAC 的开发流程，作者将用于binder开发的程序整合为一套完整工作流。如图1所示，借助 RFdiffusion 与 ProteinMPNN，分别开发靶向蛋白的多肽结合剂序列以及选定的 E3 酶对应的多肽结合剂序列。得到结合剂序列后，利用 AlphaFold2-multimer 与 ZDOCK开展分子对接以验证复合物，确定两种多肽结合剂的空间位置，该步骤对连接子序列的设计至关重要。连接子序列设计完成后，整个双功能药物分子的设计工作即宣告结束。研究进一步采用 OpenBPMD 对复合物开展补充验证。这套系统化方案实现了从结合剂序列生成到复合物验证的全流程，保障多肽 PROTAC 拥有稳定、完备的开发流程。
二、五级串联 AI 自上而下多肽 PROTAC 通用设计流水线
2.1 漏斗式层级筛选可视化
图 2 基于人工智能设计筛选多肽类药物分子流程示意图
全流程五重量化筛选标准，如图2所示，从海量构象收敛至唯一最优功能肽，全程无人工干预删选，全部依靠算法打分：
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骨架生成层 RFdiffusion 分别对 AR、VHL 蛋白各生成 8 种全新结合骨架，总计 16 套构象；
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序列优化层 ProteinMPNN 对每套骨架预测最优氨基酸组合，批量产出 64 条原始候选肽；
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单体构象质控 AlphaFold2-multimer 双重阈值过滤：pLDDT＞0.7（结构可信度）、RMSD＜2.0（预测与扩散骨架偏差），剩余 11 条高可信度肽；
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三元空间匹配 ZDOCK 分子对接 模拟 AR - 多肽 - VHL 三者空间排布，计算最优柔性连接子长度 11.4 Å，筛选适配双结合段的序列组合；
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动力学稳定性终筛 OpenBPMD MetaDynamics 增强采样分子动力学模拟三元复合物稳定度，硬性标准 CompScore＜-2，最终仅保留 1 条符合全部指标的双功能多肽。
2.2 计算层面理论突破：解决三元复合物预测失真难题
过往直接用 AlphaFold2 预测完整 PROTAC 三元复合物易出现空间错位，该研究创新分拆设计 + 后期对接策略：先独立优化 AR 结合肽、VHL 结合肽两条单配体，再通过 ZDOCK 桥接连接子，最后分子动力学验证整体构象，大幅降低 AI 多聚体预测误差，形成适用于任意靶标 + VHL 配体的通用多肽 PROTAC 计算模板，不局限于 AR 靶点，具备全领域复用价值。
三、体外多维度实验确证多肽双结合与降解功能
3.1 等温滴定量热（ITC）定量结合亲和力
采用等温滴定量热法（ITC）测定 AR PROTAC 药物与 AR 配体结合域（AR LBD）之间的结合亲和力。该 AR PROTAC 药物与 AR 配体结合域结合的解离常数为 19.4 纳摩尔。
采用等温滴定量热法（ITC）测定 AR PROTAC 药物与 VHL 蛋白之间的结合亲和力。该 AR PROTAC 药物与 VHL 蛋白结合的解离常数为 57.8 纳摩尔。如图3所示。
图 3 ITC 实验证明 PROTAC 与 AR 的相互作用
3.2 荧光偏振（FP）直接证明三元复合物形成
荧光偏振实验证实，AR PROTAC 能够促使雄激素受体（AR）与 VHL 蛋白发生结合。利用 Cy5.5 标记的 AR 蛋白与 VHL 蛋白开展体外实验，结果显示，随着多肽 PROTAC 的加入，荧光偏振值逐步升高，证明该体系成功诱导 AR 与 VHL 相结合。
实验细节：为进一步探究 PROTAC / AR / VHL 形成三元复合物的过程，研究人员使用 Cy3 荧光素对 AR PROTAC 进行标记，并按照浓度梯度逐步加入 AR 蛋白。实验观察到，荧光偏振值随 AR 蛋白浓度成比例升高，证实 AR PROTAC 能够与 AR 蛋白结合。随后研究人员加入 VHL 蛋白，发现随着 VHL 蛋白浓度上升，荧光偏振值持续增大，最终达到新的平台期。如图4所示，该变化过程证明三元复合物成功形成。
图 4 采用荧光偏振分析法检测 PROTAC / AR / VHL 三元复合物的形成
总结
该工作实现AI 计算设计 → 体外功能验证的完整闭环，其搭建的五级 AI 多肽 PROTAC 筛选流程可解决大分子降解剂设计无标准流程的行业痛点；给全球 AI 大分子药物开发、皮肤病靶向降解疗法提供可复用的完整研究范式，对计算药物化学、经皮纳米递送、PROTAC 药物多元化发展具备里程碑式参考意义。
