【Science】靶向Peptide-MHCI复合物的高特异性Binder设计

       随着生成式 AI 蛋白设计技术的成熟，一套 “计算设计驱动 - 高通量筛选验证 - 多维度功能表征” 的全流程技术体系已经成型。今天给大家分享一篇由华盛顿大学David Baker团队发表在Science上的一篇文章“Design of high-specificity binders for peptide–MHC-I complexes”。文章聚焦肽-MHC-I复合物高特异性结合剂的设计，借助深度学习蛋白质设计工具，从头设计出小型蛋白质结合物，为pMHC靶向的蛋白质及细胞疗法提供了新方法。

       研究建立了“AI 生成 - 多轮计算筛选 - 高通量实验筛选 - 多维度功能表征”的完整技术管线，覆盖从靶点结构输入到功能分子验证的全流程，可在数周内完成针对全新靶点的结合蛋白开发。

       计算设计是整个体系的核心，其核心目标是生成“以抗原肽为主要结合界面、尽可能减少与 MHC 骨架接触”的结合蛋白，从分子设计源头保障肽特异性。

研究覆盖两类靶点输入结构，验证管线的普适性：

• 实验解析结构：从 PDB 数据库获取已解析的 pMHC 复合物结构，包括 A01:01-MAGE-A3、A03:01-CTNNb1、A*02:01-HIV Env 等 8 个靶点；

• 预测结构：针对无实验结构的靶点，采用经 MHC 优化的 AlphaFold2 模型或 AlphaFold3 预测复合物结构，如 A02:01-PAP、A02:01-PRAME。

• 设计前，首先提取抗原肽中朝向溶剂侧的氨基酸残基作为“热点残基”，作为扩散模型的空间约束条件，引导生成的结合蛋白精准靶向肽段区域。

采用 RFdiffusion 生成式扩散模型进行结合蛋白骨架设计，分为两种模式：

• 从头设计模式：从随机噪声出发，通过 50 步去噪过程，生成全新的蛋白质骨架，使其贴合在 MHC 抗原结合槽上方，与抗原肽形成广泛相互作用。每个靶点生成数千至数万条独立骨架，用于后续筛选。

• 部分扩散（脚手架复用）模式：针对已验证的成熟骨架，仅在 12-25 步的去噪区间内对界面区域进行局部重构，快速适配新的抗原肽与 MHC 亚型。该模式可大幅降低计算量，提升同家族靶点的开发效率。

图1  特异性 pMHC结合蛋白的计算设计

对生成的所有骨架，使用 ProteinMPNN 模型进行氨基酸序列设计，基于三维骨架输出最优的折叠与结合序列，每个骨架生成 4-32 条不同序列，兼顾折叠稳定性与结合亲和力。

所有设计序列需经过四轮计算筛选，淘汰低质量候选，仅保留最优分子进入实验验证：

• 基础折叠与结合质量筛选：通过 AlphaFold2 分别预测结合蛋白单体结构、结合蛋白 - pMHC 复合物结构，以 pAE 相互作用评分、单体 pLDDT、设计模型与预测结构的 RMSD 为核心指标，筛选折叠稳定、结合模式可靠的设计。

• Rosetta CMS 界面特征筛选：采用 Rosetta 接触分子表面（CMS）算法，专门计算结合蛋白与抗原肽的接触面积，而非与整个 pMHC 的接触面积，优先选择肽接触占比高、MHC 接触少的设计，从结构层面保障肽特异性。

• ProteinMPNN 特异性初筛：对抗原肽进行系统性丙氨酸扫描突变，通过 ProteinMPNN 计算突变前后结合的概率变化。对肽突变敏感的分子，说明结合高度依赖肽段序列，特异性潜力更强；反之则特异性差，予以淘汰。

• AF-MHC 脱靶风险预测：使用经 MHC 微调的 AlphaFold2 模型，分别预测结合蛋白与靶肽、2-3 条同源脱靶肽的复合物结构，计算两者的 pAE 差值 ΔpAE，定量评估选择性。对脱靶肽结合置信度高的分子直接淘汰，提前规避安全性风险。

完成筛选后，优质骨架可进入下一轮部分扩散优化，通过多轮迭代持续提升分子的亲和力与特异性。

计算筛选后的候选分子，通过酵母表面展示系统进行实验水平的结合活性与特异性验证，是连接计算设计与功能分子的关键环节。

将所有设计序列两端通过 GS 接头统一长度，优化酿酒酵母密码子后，合成寡核苷酸文库，克隆至酵母展示载体，使结合蛋白展示在酵母细胞表面，同时通过 c-Myc 标签标定表达量。

采用双色荧光标记的 pMHC 四聚体与酵母细胞共孵育：PE 标记靶标 pMHC 四聚体，APC 标记脱靶 pMHC 四聚体。通过流式细胞仪分选“靶标结合阳性、脱靶结合阴性”的细胞群，即右下象限的阳性克隆。

筛选采用递进式策略：首轮使用高浓度抗原富集所有结合克隆；后续逐轮降低抗原浓度、增加脱靶竞争压力，逐步富集高亲和力、高特异性的阳性克隆。

对每一轮分选前后的酵母文库进行二代测序，通过序列富集倍数判断分子的结合能力，富集倍数越高，亲和力与特异性通常越好。最终挑选 Top 序列进行单克隆验证，获得精准的阳性结合分子。

图2  酵母表面展示文库筛选、Jurkat T 细胞鉴定以及各阳性候选分子的生化特性分析

对筛选获得的阳性克隆，进行蛋白水平的纯化与定量表征，明确其成药性参数与分子作用机制。

将结合蛋白基因克隆至 pET29b (+) 载体，C 端融合 His 标签。转化大肠杆菌后诱导表达，超声裂解后通过镍柱亲和纯化，再经凝胶排阻层析（SEC）进一步纯化，收集单体峰组分用于后续实验。

采用表面等离子体共振（SPR）技术测定结合亲和力：通过生物素捕获试剂盒将 pMHC 单体固定在芯片上，注入不同浓度的结合蛋白，监测结合与解离信号。通过全局拟合 1:1 Langmuir 结合模型，计算结合速率、解离速率与平衡解离常数（KD）。

针对代表性分子，将 pMHC 复合物与结合蛋白按比例混合共孵育，纯化后浓缩进行结晶筛选。优化后获得高质量晶体，在同步辐射光源收集衍射数据，解析原子分辨率的复合物三维结构，验证设计的准确性。

为评估结合蛋白在免疫治疗场景的功能潜力，研究将其整合至 CAR 结构中，从细胞系到原代细胞进行多维度功能验证。

CAR 骨架从 N 端到 C 端依次为：CD28 信号肽 - FLAG 标签 - 结合蛋白 - CD8 铰链区 - CD28 跨膜区 - 4-1BB 胞内结构域 - CD3ζ 胞内结构域 - P2A - 荧光蛋白 - P2A - 嘌呤霉素抗性。通过慢病毒转染 Jurkat 细胞，筛选获得稳定表达 CAR 的细胞系。

将表达 CAR 的 Jurkat 细胞与脉冲了不同肽段的抗原呈递细胞共孵育 12-18 小时，染色后通过流式细胞术检测 CD69 的表达水平，以平均荧光强度定量评估 T 细胞的激活程度与特异性。

分别对抗原肽、结合蛋白界面残基进行丙氨酸突变，通过激活实验检测突变对结合与激活的影响，明确关键作用残基，验证分子识别机制。

构建酵母展示的随机肽段 - HLA 文库，通过生物素化的结合蛋白进行多轮筛选富集，测序鉴定所有潜在结合的肽段。结合人类蛋白质组序列比对，筛选潜在自体脱靶抗原，系统性评估分子的脱靶风险。

从人外周血单个核细胞中分离 CD3+ T 细胞，激活后通过慢病毒转导构建 CAR-T 细胞。将 CAR-T 细胞与荧光素酶标记的靶细胞按不同效靶比共孵育，24h、48h 后检测发光强度计算靶细胞裂解率，定量评估特异性杀伤能力。

依托上述技术管线，研究在 11 个结构多样的 pMHC 靶点上完成了全面验证，覆盖 4 种 HLA 等位基因，靶点类型包含病毒抗原、肿瘤相关抗原与新抗原，充分证明了技术的普适性与可靠性。

研究针对 11 个靶点分别设计并合成了酵母展示文库，通过多轮 FACS 分选后，所有靶点均成功筛选到特异性结合克隆。流式检测显示，阳性克隆均可特异性结合靶标 pMHC 四聚体，几乎不结合同源脱靶肽 pMHC 四聚体，在散点图中清晰聚集于右下象限。

其中 8 个靶点通过从头扩散设计获得，另外 3 个通过部分扩散脚手架复用获得，证明两种设计模式均具备稳定的成功率。

研究对代表性分子 hiv-10（靶向 HIV Env/A02:01）与 mage-513（靶向 MAGE-A3/A01:01）进行了原核表达与纯化。

• 凝胶排阻层析结果显示，两个分子均呈现单一、对称的单体洗脱峰，无多聚体峰，说明 AI 设计的蛋白折叠正确、性质稳定，无聚集倾向，具备良好的成药性基础。

• SPR 检测显示，两个分子均达到纳摩尔级结合亲和力，远高于天然 TCR 的微摩尔级亲和力，足以支撑 CAR-T 的有效激活。其中 PRAME 靶点的 prame-2 与 prame-9 解离常数分别为 35 nM 与 96 nM，性能优异。

为从原子水平验证设计的准确性，研究解析了 mart1-3 结合蛋白与 A*02:01-MART-1 肽复合物的 2.2 Å 分辨率晶体结构。

结构比对结果显示：设计模型与晶体结构的 Cα 骨架 RMSD 仅为 0.4 Å，界面侧链的构象、氢键网络、疏水相互作用均与设计预期完全一致。mart1-3 结合蛋白精准地“扣”在 MART-1 肽的上方，通过疏水作用识别肽段第 5 位亮氨酸侧链，同时通过氢键锚定肽段第 6 位甘氨酸、第 7 位异亮氨酸与第 9 位苏氨酸的主链与侧链，所有相互作用均与设计完全吻合。

这一结果直接证明，RFdiffusion+ProteinMPNN 的设计体系具备原子级的分子设计精度，可精准编程蛋白 - 蛋白间的相互作用模式。

图3  Binder模型设计与实验验证

研究验证了部分扩散脚手架复用策略的有效性：以一个针对 A03:01 靶点的设计骨架为起点，通过部分扩散快速适配了 MAGE-A3/A01:01、gp100/A02:01、MART-1/A02:01、PRAME/A*02:01 等多个不同 HLA 亚型、不同肽序列的靶点，均成功获得了特异性结合子。

该结果证明，pMHC 结合蛋白的核心骨架具备很强的可迁移性，通过局部界面重构即可适配不同靶点，大幅缩短后续靶点的开发周期与计算成本，为规模化开发 pMHC 靶向分子库提供了可行路径。

研究将 8 个靶点的结合蛋白分别构建为 CAR，在 Jurkat 细胞中验证激活功能，核心结果如下：

• 靶肽特异性激活：所有 CAR 均仅在 APC 细胞脉冲靶肽时显著上调 CD69，激活信号强烈；脉冲同源脱靶肽时，CD69 水平与空白对照组无显著差异，证明结合蛋白的肽特异性在 CAR 水平得到了完整保留。

• 低自体背景激活：表达 HLA 的 293T 细胞表面存在大量自体肽段，但多数 CAR 仅在脉冲靶肽时激活，无明显的自体肽背景激活。其中 mage-513 的特异性最为优异，仅 MAGE-A3 肽可诱导强激活，Titin 同源脱靶肽与自体肽均无明显激活信号。

• 无实验结构靶点同样有效：针对无晶体结构的 PRAME、PHOX2B 靶点，基于 AlphaFold 预测结构设计的结合蛋白，同样成功介导了特异性的 T 细胞激活，亲和力与功能均达到实验结构靶点水平，证明预测结构完全可以作为设计起点，极大拓展了可靶向的靶点范围。

图4  不同条件下CAR-T细胞的激活强度

       这套 AI 驱动的 pMHC 结合蛋白开发体系，突破了传统筛选方法的诸多瓶颈，其技术价值与应用场景远超单一靶点开发，将在多个领域产生深远影响。

• 第一，实体瘤免疫治疗的核心工具升级。pMHC 靶向是突破实体瘤表面靶点匮乏困境的核心方向，AI 设计的结合蛋白相比天然 TCR，具备亲和力高、体积小、稳定性好、特异性可控等多重优势，可直接用于 CAR-T、TCR-T、双特异性 T 细胞衔接器等多种免疫治疗形式，大幅提升实体瘤免疫治疗的开发效率与安全性。

• 第二，技术外延拓展至更多应用场景。这套“定向约束扩散 + 多层级筛选 + 实验验证”的设计逻辑具有极强的通用性，未来可拓展至其他多肽 - 蛋白复合物、小分子抗原靶点的结合蛋白设计，为更多难成药靶点提供解决方案。